Диагностическое значение цитоморфологических, культурных и иммуногенных свойств TRICHOMONAS VAGINALIS

АЗДОЛЬСКАЯ

Наталья Владимировна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ, КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ

TRICHOMONAS VAGINALIS

14.00.46 – клиническая лабораторная диагностика

03.00.07– микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор

ИВАНОВ Андрей Михайлович

кандидат биологических наук доцент

ГАВРИЛОВА Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

 доктор биологических наук профессор

ЗЫБИНА Наталья Николаевна

доктор биологических наук профессор

РЫБАЛЬЧЕНКО Оксана Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ

Защита состоится «08» октября 2009 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан «___» сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Trichomonas vaginalis является возбудителем одного из широко распространенных заболеваний урогенитального тракта – трихомониаза (Клименко Б.В. с соавт., 2001; Дмитриев Г.А., 2003; Healy G.R., Smith J.W., 1991). Высокий уровень заболеваемости трихомониазом в Российской Федерации, и в мире, преобладание вялотекущих, малосимптомных форм со стертой клинической картиной заболевания, а также возможные разночтения результатов клинико-лабораторных исследований создают проблемы при постановке диагноза и лечении.

На протяжении многих десятилетий исследователи занимались изучением структурно-функциональных характеристик T. vaginalis типичной грушевидной формы (Беднова В.Н., 1989; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Benchimol M., 2004). Другие - нетипичные морфологические формы T. vaginalis до сих пор описаны и изучены недостаточно полно. Сложность лабораторно-диагностических процедур при трихомониазе связана с идентификацией нетипичных округлых форм простейшего в клиническом материале, а также с их дифференцировкой от других клеточных элементов (Дмитриев Г.А., 2003; Petrin D. et al., 1998; Krieger J.N. et al., 1999). Несмотря на то, что исследователи признают наличие различных форм простейшего, нормативные документы РФ по лабораторной диагностике трихомониаза регламентируют дифференцировку исключительно типичных, грушевидных форм T. vaginalis. В существующей ситуации является важным получение детальных описаний цитоморфологических характеристик всех морфотипов трихомонад, необходимых для идентификации возбудителя различными методами микроскопии. Актуально изучение цитоморфологического полиморфизма T. vaginalis, оценка их жизнеспособности в условиях культивирования и в модели инфекции in vitro.

В связи с широким использованием в лабораторной практике дополнительных методов световой микроскопии, перспективно их внедрение в лабораторную диагностику трихомониаза. Однако до сих пор многие микроскопические подходы не апробированы на практике.

Предпочтительным методом диагностики трихомониаза является культивирование возбудителя на питательных средах (Сюч Н.И., 2000; Дмитриев Г.А. с соавт., 2001; Poch F., 1996). На сегодняшний день крайне ограничены сведения о метаболизме вирулентных форм, которые не удается поддерживать длительное время в периодических культурах. Составы сред не оптимальны, практически не изучено влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства простейших. В связи с этим необходима дополнительная работа по изучению биологических свойств возбудителя in vitro.

Серологические методы исследования используются исключительно в качестве вспомогательных тестов. Сложности интерпретации результатов иммуноферментного анализа возникают из-за отсутствия экспериментальных данных по его использованию.

Эпидемиологические исследования и изучение биологических свойств T. vaginalis невозможно без создания коллекции вирулентных штаммов. При невозможности длительного культивирования единственным способом сохранения является криоконсервирование (Habib F.S., 2004; Matsuo A., 2007). До сих пор отсутствует методика по длительному криосохранению T. vaginalis, а также оценки выживаемости на разных сроках.

Цель исследования: определить диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis и обосновать рекомендации по повышению эффективности лабораторной диагностики трихомониаза.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоморфологический полиморфизм и дать характеристики клинических изолятов T. vaginalis с использованием различных методов микроскопии.
2. Охарактеризовать полиморфизм T. vaginalis на культуре клеток в модели инфекционного процесса in vitro.
3. Изучить влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства T. vaginalis.
4. Оценить фагоцитарную активность различных цитоморфологических форм T. vaginalis.
5. Оптимизировать методику криоконсервации T. vaginalis, оценить ее эффективность и сформировать банк штаммов трихомонад.
6. Получить трихомонадные антигены и изучить в иммуноферментном анализе уровень и частоту обнаружения положительных результатов при выявлении противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.
7. Оптимизировать процедуру проведения иммуноблоттинга с лизатом чистой культуры T. vaginalis и выявить наиболее иммуногенные антигены.

Научная новизна работы.

Впервые разработаны критерии идентификации нетипичных цитоморфологических форм клинических изолятов T. vaginalis, выявляемых при микроскопической диагностике трихомониаза. На основе фагоцитарной активности доказана жизнеспособность нетипичных морфологических форм трихомонад. В модели инфекционного процесса in vitro установлены закономерности полиморфизма T. vaginalis в различные стадии взаимодействия с культурами клеток. Для культуральной диагностики трихомониаза определен оптимальный состав питательной среды на основе клеточной линии MDCK с внесением сыворотки крови, позволяющей выявлять нетипичные морфотипы трихомонад на ранних сроках культивирования.

Теоретическая и практическая значимость.

Показано, что при микроскопической и культуральной диагностике трихомониаза наиболее часто выявляются нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы T. vaginalis. Описанные формы трихомонад жизнеспособны, и в связи с этим они должны учитываться при лабораторной диагностике трихомониаза.

Экспериментально обоснованные оптимальные составы питательной среды TYM с внесением сыворотки крупного рогатого скота, а также клеточной линии MDCK, позволяют накапливать максимальные концентрации T. vaginalis округлого морфотипа на ранних сроках культивирования, что повышает чувствительность лабораторной диагностики трихомониаза.

Разработанная оригинальная методика криоконсервации может быть использована для создания банка референс-штаммов T. vaginalis, необходимого для оценки качества лабораторных исследований. Сконструированная иммуноферментная тест-система для обнаружения противотрихомонадных IgG-антител может использоваться в дополнение к существующим диагностическим подходам. Установлено, что трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа является наиболее иммуногенным и перспективен для создания его искусственного аналога с целью стандартизации серологической диагностики трихомониаза.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу Научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Ленинградского областного КВД» (С.-Петербург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы T. vaginalis являются жизнеспособными, участвуют в развитии инфекционного процесса и должны учитываться в лабораторной диагностике трихомониаза.
2. Охарактеризованные цитоморфологические и ультраструктурные признаки нетипичного округлого морфотипа T. vaginalis с применением различных методов микроскопии позволяют дифференцировать их от других клеточных элементов, что является необходимым критерием для повышения эффективности микроскопической диагностики трихомониаза.
3. Разработанная модель инфекционного процесса in vitro с использованием клеточных культур и оптимизация питательной среды позволяет изучать механизм патогенеза и особенности цитоморфологической изменчивости T. vaginalis.
4. Серологическая диагностика трихомониаза носит вспомогательный характер. Наибольшей иммуногенностью обладает белковый антиген T. vaginalis с молекулярной массой 50 кДа. Данный белок является перспективным для создания иммуноферментной тест-системы для выявления противотрихомонадных IgG-антител.
5. Создание криобанка штаммов T. vaginalis способствует стандартизации и воспроизводимости результатов лабораторной диагностики трихомониаза.

Личный вклад автора.

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все микроскопические исследования, включая электронную микроскопию; создана база микрофотографий; проведено культивирование штаммов T. vaginalis и поддержание их в состоянии глубокой заморозки; поддерживались клеточные линии, и осуществлялось моделирование инфекционного процесса; выполнен весь комплекс серологических исследований.

Автором лично планировались исследования, формировалась база данных и проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.-Петербург, 2005); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.-Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова (С.-Петербург, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008); Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (С.-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); 1-ом Евразийском конгрессе дерматовенерологии, косметологии и эстетической медицины (Астана, Казахстан, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 41 печатная работа, в том числе 37 – в сборниках материалов конференций, 4 статьи в журналах по перечню ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 47 отечественных и 84 зарубежных. Текст содержит 18 таблиц, 1 формулу и 31 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в период с 2006-2009 гг. Культуры T. vaginalis получали из клинического материала пациентов, обращавшихся с жалобами на урогенитальные расстройства в клиники Санкт-Петербурга: кожно-венерологические диспансеры (КВД) №3, №4; Ленинградский областной КВД; клинику кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Центральный Военно-морской госпиталь №1; Окружной Военный клинический госпиталь (ОВКГ) №442 им. Соловьева.

Для анализа морфологии T. vaginalis использовали комплекс современных микроскопических методик в сочетании с диагностическими методами окрашивания. Микроскопию нативного препарата осуществляли по методике «раздавленная капля». Окраску клинического материала проводили 1% водным метиленовым синим (НИЦФ, С.-Петербург) и по Май-Грюнвальду-Гимзе (набор Kit Ral 555) (Reactifs RAL, Франция). Для просмотра окрашенных препаратов использовали микроскоп МИКМЕД-5 и микровизор проходящего света µVizo-103 (ЛОМО, С.-Петербург). Регистрацию изображений проводили с помощью полифункционального исследовательского микроскопа Leica DMRXA, оснащенного фазово- и дифференциально-интерференционными контрастными (ДИК) насадками и Leica DM-1000. Электронную микроскопию трихомонад проводили методом ультратонких срезов с использованием трансмиссионного микроскопа JEM-Jeol 100M.

Для культивирования и выделения T. vaginalis использовали модифицированный вариант питательной среды TYM с добавлением лошадиной сыворотки (Биолот, С.-Петербург), сыворотки крупного рогатого скота (Биолот, С.-Петербург), сыворотки человека и эмбриональной сыворотки коров (Биолот, С.-Петербург) и коммерческий вариант среды для выделения трихомонад (СВТ), производства отдела новых технологий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (С.-Петербург).

Для моделирования инфекционного процесса in vitro и характеристики вирулентных форм применяли различные клеточные линии: Hep-2 – культура клеток карциномы гортани человека, L-41 – культура клеток лимфобластоидного происхождения, MDCK – культура клеток почки собаки, MA-104 - культура клеток почки эмбриона макаки-резус, культивированные по стандартным методикам (Адамс Р., 1983) в соответствии с рекомендациями соответствующего паспорта. Монослой клеток выращивали в культуральных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в ростовой среде (199 и α-МЕМ, в соотношении 1:1) (Биолот, С.-Петербург). Суспензию T. vaginalis в концентрации, соответствующим задачам исследования вносили непосредственно в среду и культивировали при 37⁰С и 5% СО₂. Учет результатов проводили в инвертированном микроскопе МИП-01 (ЛОМО, С.-Петербург) через 1, 3, 6 и 24 часа инкубации.

Фагоцитарную активность различных морфологических форм T. vaginalis изучали по захвату клеток культуры Staphylococcus aureus ATCC 25923. В суспензию T. vaginalis вносили S. aureus (10⁹ кл/мл), смесь инкубировали и затем фиксировали нагретым (37⁰С) фиксатором (MTSB буфер и 4% раствор параформальдегида). После отмывки вносили DAРI (Sigma) (5 мкг/мл), инкубировали в течение 1 часа и просматривали в конфокальном микроскопе Leica TCS SP 5.

ИФА проводили с использованием коммерческой иммуноферментной тест-системы «ТрихомоноБест-IgG стрип» (Вектор-Бест, Россия) и в модифицированном варианте, в котором в качестве иммуносорбента использовали лизатный трихомонадный антиген, полученный различными методами. Твердой фазой в ИФА служили 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола (Costar, США). Специфический комплекс антиген-антитело выявляли с использованием пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител, направленных к изотипспецифичным эпитопам IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Все моноклоны были получены из лаборатории гибридомных технологий ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи (руководитель д.м.н., профессор Климович В.Б.). Оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции измеряли на вертикальном фотометре Multiscan-MC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Иммуноблоттинг проводили с ультраозвученным антигеном T. vaginalis. Электрофорез осуществляли в 12,5% разрешающем геле и концентрирующем геле при градиенте напряжения 100 В и 200 В. Перенос осуществляли на поливинилиден-дифлюоридную (PVDF) мембрану с последующей инкубацией с сыворотками больных трихомониазом (I антитела) и с конъюгатом (смесь моноклональных антител против κ и λ цепей, меченных ферментом пероксидаза хрена) (II антитела). Проявку мембраны осуществляли в смеси H₂O₂ и хлорнафтола. Результаты иммуноблоттинга обрабатывали с использованием компьютерной программы Gel-pro31.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микроскопические исследования различных морфологических форм T. vaginalis

В ходе работы проведено микроскопическое исследование 1912 клинических препаратов, полученных от мужчин и женщин, обратившихся с жалобами на урогенитальные расстройства. Положительный результат был получен в 252 случаях. T. vaginalis выявлены у 187 мужчин и 65 женщин (16,3% и 8,5%, соответственно). Использование световой микроскопии витальных препаратов позволило идентифицировать различные морфологические формы T. vaginalis: типичные грушевидные и нетипичные округлые. Грушевидные формы T. vaginalis были выявлены у 47 больных (25,1%), округлые у 140 (74,9%).

При анализе результатов проведенных микроскопических методов установлены основные цитоморфологические признаки округлого морфотипа T. vaginalis. При микроскопии нативных препаратов у трихомонад нетипичной морфологии наблюдали значительную вакуолизацию и грануляцию цитоплазмы, отсутствие ундулирующей мембраны и аксостиля. Отличающими признаками T. vaginalis от дегенеративных хозяйских клеток являлись меньшие размеры трихомонад и вакуолизация цитоплазмы.

При исследовании фиксированных окрашенных метиленовой синью препаратов клетки округлого морфотипа трихомонад трудно дифференцировать от других клеточных элементов. По-видимому, фиксация препаратов и взаимодействие с красителем приводит к существенному изменению морфологии T. vaginalis. Окрашивание препаратов по Май-Грюнвальду-Гимзе позволило четко дифференцировать округлые морфотипы по наличию сильно вакуолизированной цитоплазмы, с крупным ядром, имеющим неравномерно прокрашенные зоны, отчетливых жгутиковых корешков и свободных жгутиков, лежащих на поверхности клетки, окрашенного аксостиля, не выходящего за пределы клетки. В округлых клетках отсутствовала ундулирующая мембрана. При использовании данной окраски выявляли значимые дифференциальные отличия различных морфотипов T. vaginalis.

Округлые формы T. vaginalis отчетливо дифференцировали при использовании фазово-контрастной микроскопии и дифференциально-интерференционного контраста по отсутствию подвижности, но с наличием на переднем конце укороченных, удаленных друг от друга свободных 2-3 жгутиков, отсутствием ундулирующей мембраны. Их размер существенно не отличался у мужчин (10-12 мкм) и у женщин (12-14 мкм).

При сравнительной оценке микроскопических подходов в дифференцировке T. vaginalis округлой формы фазово-контрастная микроскопия и дифференциально-интерференционный контраст были наиболее информативными. Данные виды микроскопии позволили однозначно дифференцировать все доступные на светооптическом уровне цитоморфологические признаки округлых клеток T. vaginalis: форму и размеры ядра, вакуолизацию цитоплазмы, наличие жгутиков. Характерная структура цитоплазмы округлых форм T. vaginalis была связана с наличием особых органелл - гидрогеносом.

Микроскопические методы лабораторной диагностики трихомониаза являются первоочередными при проведении скрининговых исследований. Результаты данного исследования имеют особую ценность, поскольку предоставляют экспрессные данные о характере заболевания и течении инфекционного процесса.

Для изучения ультраструктурных особенностей различных морфотипов T. vaginalis провели электронную микроскопию. Показали, что округлая и грушевидная форма T. vaginalis имеют общий план строения клетки. Однако у округлых форм в цитоплазме клетки отмечали характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками (табл. 1).

У округлых морфологических форм T. vaginalis наблюдали частичную, структурную деградацию синтетического аппарата, редукцию околоядерной эндоплазматической сети и связанной с ней аксостилярной области, редукцию транс Гольджи сети, изменение характера содержимого гидрогеносом, изменение структуры хромосомного аппарата.

Подобные изменения указывают на снижение метаболической активности T. vaginalis округлого морфотипа по сравнению с грушевидными.

Таблица 1

Сравнительная характеристика цитоморфологических форм T. vaginalis

Анализ параметров роста T. vaginalis in vitro, моделирование инфекционного процесса и создание банка штаммов

Задача оптимизации условий культивирования и состава сред остается чрезвычайно актуальной на сегодняшний день. Особенности метаболизма и физиологии T. vaginalis полностью не исследованы, поскольку культивирование штаммов in vitro приводит к потере вирулентности (Honinberg B.M., 1990; Benchimol M., 2004). Успешное решение проблемы культивирования существенно разовьет фундаментальные исследования биологии трихомонад и будет способствовать эффективной диагностике трихомониаза.

Оптимизация питательной среды для культивирования T. vaginalis

В качестве основы была выбрана питательная среда Trypticase yeast medium (TYM), рекомендуемая в качестве «золотого стандарта» для культуральной диагностики трихомониаза, а также для поддержания штаммов (Diamond L.S., 1957; Poch F., 1996; Clark C.G., Diamond L.S., 2002). Многие исследователи предлагают вносить в состав среды сыворотки различного происхождения. Однако в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии источника сыворотки на рост вирулентных форм T. vaginalis.

В исследования были включены различные варианты среды TYM с добавлением лошадиной сыворотки (№1), сыворотки крупного рогатого скота (№2), сыворотки человека (№3), эмбриональной сыворотки коров (№4), в качестве контроля использовали среду без добавления сыворотки (№5). Количественный и дифференциальный подсчет клеток проводили в камере Горяева на 3, 4, 5, 7 и 9 сутки культивирования.

Все среды характеризовались длительным (2-4 суток) лаг-периодом; самую короткую лаг-фазу наблюдали на среде №3, самую продолжительную – на среде №2. Максимальный прирост клеток зарегистрировали на среде №4 (в среднем до 65,0 х 10⁸ кл/мл) на 5-е сутки, причем концентрация клеток не сокращалась до окончания опыта. Минимальный прирост клеток был на среде №1 (в среднем до 26,0 х 10⁸ кл/мл) на 4-е сутки. Динамика роста числа клеток на среде №2 сходна с таковой на среде №4, однако максимальные концентрации существенно ниже (до 42,0 х 10⁸ кл/мл). Раньше всего (на 4-е сутки) наблюдали максимальные концентрации на среде №3 (до 51,0 х 10⁸ кл/мл); при этом уже через сутки концентрация резко сокращалась (рис. 1).

Для накопительных культур благоприятна среда №3 (с сывороткой человека), поскольку быстрее всего происходило накопление характерных грушевидных клеток. Следует отметить, что эта стадия очень кратковременная, немедленно вслед за накоплением максимальных концентраций начинался переход в округлые формы и гибель трихомонад. Эта среда может использоваться для диагностики трихомониаза. Продолжительней всего грушевидные формы поддерживались на среде №2 (с сывороткой крупного рогатого скота). Сочетание достаточно высокого прироста числа клеток и стабильность морфологии позволило рекомендовать эту среду для поддержания штаммов и для диагностических целей.

Для накопления максимальной биомассы и поддержания штаммов трихомонад в лаборатории можно рекомендовать среду №4 (с эмбриональной сывороткой). Эта среда позволяет накапливать не только грушевидные, но и округлые формы. На 5-е сутки на этой среде происходит переход в округлые формы, причем концентрация клеток не сокращается, а даже несколько увеличивается. Однако высокая стоимость этой сыворотки ограничивает возможность ее широкого использования в клинических лабораториях.

Сыворотка крупного рогатого скота является оптимальной для внесения в основу питательной среды TYM для культуральной диагностики T. vaginalis. Следует особо отметить, что при данном методе положительным результатом является также регистрация в образцах округлых неподвижных морфотипов трихомонад.

Оптимизация условий культивирования T. vaginalis при моделировании инфекционного процесса

Для оптимизации условий культивирования T. vaginalis использовали математическую модель полнофакторного эксперимента. Оптимизацию проводили при моделировании инфекционного процесса с использованием двух контролируемых факторов: клеточных линии клеток (фактор А) и вариантов питательной среды TYM, обогащенных сыворотками (фактор В). Клеточные линии подразделялись на 3 уровня - Hep-2 (рак гортани человека); MA-104 (эмбриональный почечный эпителий макаки резус); MDCK (почечный эпителий собаки), а среда TYM на 5 уровней: без сыворотки (с), с сывороткой крупного рогатого скота (КРС), эмбрионов коров (СЭК), лошадиной (ЛС) и человека (СЧ).

Результаты предварительного анализа показывали, что на 3-е сутки культивирования достигается максимальный рост T. vaginalis в среднем до 20,0 х 10⁸ кл/мл. Этот срок культивирования был выбран для оценки степени влияния изучаемых факторов на рост T. vaginalis.

Оценку степени влияния (Kj) факторов клеточной линии и питательной среды, а также их взаимодействия на прирост T. vaginalis рассчитывали по величине сумм квадратов отклонений данного показателя от средних значений по формуле:

Kj – степень влияния, в %

SSj – сумма квадратов отклонений параметра (прироста T. vaginalis) от среднего значения вследствие влияния на него факторов (клеточной линии и среды)

SS – общая сумма квадратов отклонений параметра (прироста T. vaginalis) от среднего значения вследствие влияния на него всех контролируемых, неконтролируемых, случайных факторов и ошибок измерения.

Контролируемые факторы и их взаимодействие объяснили основную часть дисперсии на 80,0% (табл. 2).

Таблица 2

Оценка степени влияния различных факторов на величину коэффициента позитивности

Степень их влияния значима (р<0,001). Из контролируемых факторов наибольшее влияние оказывала питательная среда (44,0%) и в меньшей степени взаимодействие двух факторов одновременно – линия клеток и среда (11,0%).

Средние значения и 95% доверительные интервалы на различных уровнях факторов представлены на рис. 3 и 4 и при их сочетаниях (рис.5).

Рисунок 5. Концентрации T. vaginalis при различных сочетаниях клеточных линий и питательных сред

Оценка эффективных концентраций T. vaginalis при моделировании инфекционного процессаin vitro

Для определения минимальной инфицирующей концентрации T. vaginalis в отношении клеточного монослоя был смоделирован инфекционный процесс с использованием клеточных линий Hep-2 и L-41.

При инфицировании монослоя штаммами T. vaginalis в концентрации х10⁸ кл/мл его полное разрушение происходило в течение первого часа. При инфекционной дозе х10⁶ кл/млначальную деструкцию монослоя наблюдали через 12 часов инкубации, а полное его разрушение - в течение 24 - 48 часов, в это же время концентрация паразита достигала максимума - 10⁷ кл/мл. При инфекционной дозе х10⁴ и х10² кл/мл деструкцию клеточного монослоя отмечали через 36 ч и 48 ч, а полное разрушение – через 96 часов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разрушение монослоя начинается при концентрациях трихомонад на порядок меньших концентраций эпителиальных клеток. Полная деструкция монослоя наступала при уравнивании концентраций паразита и хозяина. Отмечено также, что динамика инфекционного процесса не зависит от типа клеточной культуры и штамма паразита.

Анализ цитоморфологических изменений T. vaginalis при контакте с клеточными линиями

Изучение цитоморфологических изменений T. vaginalis проводили в условиях in vitro с использованием линий L-41 и Hep-2 путем окрашивания препаратов по Май-Грюнвальду Гимзе и нативной микроскопии.

На начальной стадии взаимодействия популяции грушевидных подвижных морфотипов T. vaginalis с монослоем происходило их прикрепление к монослою. Морфология трихомонад изменялась с грушевидной на амебоидную форму с потерей жгутиковой подвижности, но с сохранением свободных жгутиков, происходила редукция ундулирующей мембраны, изменялось положение аксостиля, формировались псевдоподии. Через 12 ч инкубации в зонах разрушенного монослоя образовывался псевдоплазмодий трихомонад. В популяции амебоидных форм трихомонад отмечался значительный полиморфизм по размерам и форме, при этом около 25% клеток были двуядерные или многоядерные у которых отчетливо выявлена амплификация жгутикового аппарата. Эти формы являются делящимися клетками с отложенным цитокинезом. Однако при окрашивании картины деления отличались от таковых у грушевидных форм. Процент делящихся клеток в популяции грушевидных форм составил всего 6-7%. По мере разрушения монослоя часть амебоидных форм теряла контакт с клетками – хозяевами. В суспензии появлялись, округлые неподвижные, сильно вакуолизированные формы, сохраняющие морфологию амебоидных форм, но не формирующие псевдоподии. После полного разрушения монослоя у паразита прекращалось активное деление, и округлая форма переходила в типичную грушевидную с ундулирующей мембраной, выраженным аксостилем и с гомогенной цитоплазмой. Полученные на модели in vitro данные позволили описать округлые и амебоидные морфотипы как стадии инфекционного процесса. Их морфология варьировала в зависимости от степени прикрепления простейших к клеткам-хозяевам. Наличие округлых клеток в клиническом материале может свидетельствовать о наличии активной стадии инфекции. Типичные грушевидные формы, появляющиеся при полном разрушении монослоя в эксперименте in vitro и, по-видимому, в условиях in vivo, могут рассматриваться как расселительная стадия.

Изучение фагоцитарной активности у различных морфотипов T. vaginalis 

Для оценки вирулентности и жизнеспособности различных морфотипов T. vaginalis проводили исследование по изучению их способности к фагоцитозу. Исследовался фагоцитоз у грушевидных, округлых и амебоидных морфотипов T. vaginalis (7,0 – 8,0 х 10⁵кл/мл) при инкубации со Staphylococcus aureus (х10⁹ кл/мл). Фагоцитоз рассматривается некоторыми исследователями как фактор вирулентности у трихомонад (Pereira-Neves A., Benchimol M., 2007). Оценивали содержание бактерий в цитоплазме простейшего с использованием конфокальной микроскопии методом прямого учета. Только конфокальная микроскопия позволяет достоверно судить о расположении частиц: на поверхности, под клеткой, или внутри нее. Показали, что грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы T. vaginalis способны к фагоцитозу S. aureus. Фагоцитарная активность сокращалась в ряду амебоидные (5-12 бак./кл.) > грушевидные (5-6 бак./кл) > округлые (2-3 бак./кл.) морфотипы. На основании оценки фагоцитарной активности, наиболее вирулентными являются амебоидные морфотипы, в то же время округлые наименее вирулентные, однако их следует рассматривать как жизнеспособные, а не дегенеративные формы.

Криоконсервация штаммов T. vaginalis

На первом этапе проводили очистку штаммов T. vaginalis от бактериально-микотической флоры. Процедуру очистки проводили на 9 штаммах T. vaginalis Длительность очистки составляла по срокам от двух недель до двух месяцев и зависела от исходной контаминации штамма трихомонад. В смесь культуральной среды (α-MEM и199) вводили комплекс из пяти антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина) по 400-600 ЕД/мл, а также амфотерицин В – 5 ЕД/мл. Длительность обработки для разных штаммов T. vaginalis различалась и находилась в пределах от 5-6 пассажей до 10-15. Далее проводили «быстрое» пассирование T. vaginalis на образцах монослоя L-41 или Hep-2 с длительностью контакта от 3-4 часов до 24 часов и с сохранением 50% монослоя с адгезировнными трихомонадами. Данные процедуры многократно повторяли до получения чистой культуры T. vaginalis. Полученную суспензию трихомонад ресуспендировали в криозащитной среде, содержащей 30% сыворотки КРС, 5-7% ДМSО и 5% ростовой среды для культур клеток. Проводили стадийное замораживание: +20⁰С → +3⁰С →-30⁰С (охлаждение 1⁰С в мин. в спиртосодержащей жидкости) → -55⁰С (охлаждение 5⁰С в мин.) → -70⁰С →-196⁰С. Процесс размораживания осуществляли при температуре от +40 до +45⁰С. Жизнеспособность всех штаммов трихомонад находилась в пределах от 70 до 90%. Криобанки были подготовлены для 9 штаммов T. vaginalis.

Изучение информативности серологической диагностики трихомониаза

Для выяснения роли серологического метода, в частности, иммуноферментного анализа для диагностики трихомониаза, нами была сконструирована ИФА тест-система на основе цельноклеточного антигена T. vaginalis, полученного методом ультраозвучивания. Оптимизация концентрации антигена проводили в пределах от 5 мкг/мл до 30 мкг/мл (рис. 6).

Рисунок 6. Зависимость коэффициента позитивности в ИФА от концентрации трихомонадного антигена, полученного методом ультраозвучивания.

Оптимальная концентрация антигена T. vaginalis составила 15 мкг/мл (рис. 6). Тестировали панель сывороток крови 89 пациентов, полученных от мужчин и женщин с диагнозом трихомониаз. Общая чувствительность обнаружения специфических иммуноглобулинов составила 30,3% (n=27). У женщин частота обнаружения положительных результатов в ИФА была выше (66,7%), по сравнению с мужчинами (8,9%) (р<0,05). В частности у женщин с острой формой трихомониаза чувствительность ИФА составила 91,7%, а у мужчин 3,4%.

Высокая чувствительность ИФА у женщин обусловлена преобладанием в клиническом материале от них грушевидных, подвижных морфотипов трихомонад. В материале, полученном у мужчин, в большинстве случаев выявлялись округлые морфотипы. По-видимому, грушевидные формы обладают более выраженной иммуногенностью и характеризуются наличием большего количества антигенов. Другим предположением является анатомо-физиологические особенности урогенитального тракта. У женщин в урогенитальном тракте вследствие благоприятных условий существования - рН, наличие факторов роста наблюдается большая концентрация возбудителя. У мужчин вследствие анатомических особенностей регулярное мочеиспускание приводит к постоянному изменению физико-химических условий в уретре и снижению концентрации возбудителя. Предполагается, что высокая интенсивность формирования пула антителопродуцирующих лимфоцитов и последующая выработка иммуноглобулинов в организме женщин может быть связана со сравнительно большей площадью взаимодействия микробных антигенов и слизистых оболочек урогенитального тракта.

Анализ результатов проведенного ИФА по обнаружению противотрихомонадных подклассов иммуноглобулинов IgG у больных трихомониазом позволил выявить несколько типов иммунного ответа. Первый тип иммунного ответа характеризовался абсолютным преобладанием субизотипов IgG2. При втором типе иммунного ответа наблюдались подклассы IgG2 и IgG3. Третий тип иммунного ответа отличался относительным преобладанием в пуле противотрихомонадных антител субизотипа G3. Известно, что по синтезу иммуноглобулинов класса G, можно предположить химическую природу антигенов, преимущественно реагирующих в составе иммуносорбента. По всей вероятности при первом типе в связывании антител основное место принадлежит полисахаридам, а при третьем антигенам белковой природы. Второй тип иммунореактивности может быть связан с антителами, как к белковым, так и полисахаридным антигенам.

Проведенный иммунноблоттинг показал, что наибольшей иммуногенностью обладает белковый антиген с молекулярной массой 50 кДа, который может быть перспективным для создания его искусственного аналога. Молекулярная масса 50 кДа соответствует массе основных цитоскелетных белков, образующих корешковую систему внутри клетки простейшего, один из этих белков – актинин уже был описан как специфичный антиген (Addis M.F. et al., 1999).

ВЫВОДЫ

1. При лабораторной диагностике трихомониаза микроскопическими и культуральными методами в большинстве случаев выделяются нетипичные округлые, неподвижные морфотипы T. vaginalis (74,9%). Применение фазово-контрастной микроскопии и дифференциально-интерференционного контраста позволяет дифференцировать все доступные цитоморфологические признаки округлого морфотипа, что повышает эффективность витальной микроскопии. Использование электронной микроскопии показало наличие деления у округлых морфотипов T. vaginalis, что свидетельствует об их принадлежности к одной из стадии жизненного цикла простейшего.
2. При взаимодействии типичных грушевидных морфотипов T. vaginalis с монослоем происходит переход в амебоидные морфотипы. При потере контакта данные формы переходят в округлые морфотипы, а полное разрушение монослоя индуцирует переход в грушевидный морфотип. В разработанной модели инфекционного процесса in vitro происходит воспроизведение нетипичных цитоморфологических форм T. vaginalis, являющихся активно размножающимися стадиями жизненного цикла.
3. Комбинация питательной среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота и клеточной линией MDCK позволяет достичь максимальной концентрации T. vaginalis, что способствует повышению эффективности культуральной диагностики трихомониаза.
4. Наличие фагоцитарной активности доказывает жизнеспособность нетипичных округлых и амебоидных цитоморфологических форм T. vaginalis. При лабораторной диагностике трихомониаза должны учитываться все цитоморфологические формы клинических изолятов T. vaginalis.
5. Разработанная методика криоконсервации штаммов T. vaginalis позволяет создать банк референтных штаммов простейших, сохраняющих свои биологические свойства в течение 2-х лет, что необходимо для повышения качества лабораторной диагностики трихомониаза.
6. Иммуноферментная тест-система по обнаружению противотрихомонадных IgG-антител на основе цельноклеточного антигена T. vaginalis имеет общую чувствительность 30,3% и может использоваться только в качестве вспомогательного метода исследования. При острой форме трихомониаза ИФА имеет высокую чувствительность у женщин (91,7%), по сравнению с мужчинами, у которых этот показатель составляет 3,4%.
7. Трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа обладает наибольшей иммуногенностью и может быть рекомендован для стандартизации серологической диагностики трихомониаза путем введения его искусственного аналога в состав иммуносорбента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, микробиологии и дерматовенерологии в медицинских учреждениях.
2. Грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы жизнеспособны и являются стадиями инфекционного процесса. При микроскопической диагностике трихомониаза необходимо учитывать все морфологические формы T. vaginalis
3. Для культуральной диагностики трихомониаза предпочтительно использовать питательную среду TYM, обогащенную сывороткой крупного рогатого скота, в связи с длительным поддержанием на ней округлых морфотипов.
4. Для повышения диагностической эффективности культуральной диагностики трихомониаза по выявлению нетипичных цитоморфологических форм T. vaginalis необходимо применять комбинацию клеточной линии MDCK и среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота.
5. Криоконсервацию T. vaginalis целесообразно проводить при следующих условиях: очистка штаммов смесью антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина и амфотерицин В); многократное пассирование на монослое; помещение в криозащитную среду (30% сыворотки КРС, 5-7% ДМSО и 5% ростовой среды для культур клеток), стадийное замораживание от +20⁰С до → -70⁰С → -196⁰С и размораживание при +40.